J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC磷酸化代谢

生命癌症观感借助于弱小而比较简单的细胞核葡萄糖，或许是由胃组织的高碳性造成的。由于活性碳(ROS)的转化是这种葡萄糖的氢化，因此需要以烟甲基腺嘌呤二核苷醛磷醛(NADPH)的形式来增大硝醛应激，以应对这种细胞核活性的提升。烟甲基单核苷醛转移蛋白质(NNT)可通过NADPH的转化来持续细胞核的抗硝醛控制能力，但其在非小细胞内质癌症(NSCLC)之中的功用未曾明确。本研究成果辨认出NNT的暗示在癌症果蝇基本概念之中显着提升了的演化成和侵扰性。另除此以外，进一步研究成果辨认出NNT不足之处则会日益不堪重负细胞核动态障碍，这与硝醛应激的大量减少无关，而是以核糖核酸细胞内的活性增大为图标。这些弱点与NADPH的持续性和ROS的受益有关，这声称NNT在大大降低这些决定性细胞内辅因子的硝醛之中起着决定性功用。

实验设计

许多常见的癌症果蝇基本概念是透过C57BL6/J果蝇的圈养战略而构建。寻常的是，这些果蝇载有纯合核苷醛7-11的框内不足之处以及细胞核之中Nnt基因序列的错义等位基因日益不堪重负非动态细胞内的暗示。因此，可以透过这种其本质不足之处的等位基因(NntΔex7-11)来评价NNT对癌症频发的制约。

首先，用于Kras等位基因(LSL-KrasG12D/+)惹来的癌症基本概念来检测Nnt暗示对癌症频发的制约。载有Cre重组蛋白质的腺病毒感染LSL-KrasG12D/+果蝇，可正向KrasG12D在胃上皮之中的暗示和胃脑瘤的演化成。透过LSL-KrasG12D/+果蝇和C57BL6/J果蝇产卵诱发Nnt+/+暗示果蝇或NntΔex7-11/Δex7-11暗示果蝇(平面图1A-1B)。该基本概念之中Nnt的暗示日益不堪重负Cre重组蛋白质诱发的节省成本减很慢3个月(平面图1C-1D)。然后，透过Kras等位基因与p53不足之处同时暗示(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也叫作KP)构建癌症基本概念。Nnt的暗示未变动Cre正向的KP果蝇的存活率(平面图1E)。寻常的是，在这个基本概念之中，p53的不足之处消除了Nnt暗示对癌症演化成的制约，并且无论Nnt暗示如何，实验终于都具体来说显着的节省成本(平面图1F)。癌症节省成本分之一的量化在相同表型果蝇彼此之间未差别(平面图1G-1H)。

虽然相同表型果蝇彼此之间的节省成本未差别，但确实检视到基本概念之中侵扰性的差别。我们辨认出Nnt+/+果蝇之中51.3%的为3级(脑瘤)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11果蝇之中有数36.5%和38.8%的是高级(平面图1I)。Nnt+/+果蝇频发4级的频率显着减少，断言了侵扰性的转变(平面图1J)。总之，这些信息声称Nnt有利于了癌症的频发和侵扰。

2 NNT的不足之处不制约细胞核之中硫碳还细胞内(TXN)的抗硝醛体系

为了进一步风险评估NNT对癌症生态学的制约，首先风险评估shRNA妨碍NNT细胞内的暗示，包括4个暗示NNT细胞内的NSCLC细胞内质系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不暗示NNT细胞内的H441细胞内质(平面图2A)。妨碍NNT细胞内暗示抑制NSCLC细胞内质的增殖控制能力(平面图2B)。并且辨认出很慢病毒感染4同月NNT的缩水增大了H2009和PC9细胞内质的生存控制能力(平面图2C)。此除此以外，H441细胞内质的增殖不受NNT的制约。

通常认为NNT有助于NADPH的转化成控制能力，从而持续细胞核细胞内抗硝醛系统处于转化成静止状态(平面图2D)。妨碍NNT增大了H1299、H2009和PC9细胞内质之中NADPH: NADP+的分之一 (平面图2E)。很慢病毒感染4同月细胞核之中H2O2显着减少(平面图2F)，所以NNT对H2O2药操作过程很举足轻重。

为了明确这些细胞核ROS的减少到底与细胞核抗硝醛系统有关，于是透过Western blotting风险评估细胞核之中过硝醛物细胞内3(PRDX3)的硝醛静止状态。H2O2通过PRDX3药，即一对胺基醛残基正向PRDX3演化成丝氨醛，并且必须通过TXN转化成这些胺基醛残基才能转化成PRDX3的抗硝醛动态。PRDX3丝氨醛的受益是PRDX3硝醛的图标，是细胞核硝醛应激的常用图标物。

奥拉诺芬是一种TXN转化成蛋白质(TRXR)衍生物，虽然奥拉诺芬的疗程则会日益不堪重负PRDX3细胞内大量硝醛，但NNT的不足之处并未减少PRDX3的硝醛(平面图2G)。此除此以外，NNT的不足之处也未增大细胞核TXN2或TRXR2的细胞内水准。总之，这些结果声称NNT在NSCLC细胞内质增殖控制能力上发挥举足轻重功用，但NNT活性的归因于未必则会损害细胞核TXN抗硝醛系统，也不则会惹来显着的硝醛应激。

3 NNT的不足之处则会损害细胞核的硝醛控制能力

鉴于NNT在IMM之中的定位及其制约膜上氢辐射能和转化成控制能力，于是试平面图探讨NNT对细胞核硝醛葡萄糖到底举足轻重。首先，用于海马细胞内质除此以外辐射能统计分析仪透过细胞核担忧测试者，风险评估NNT不足之处对一般细胞核硝醛动态的制约。结果辨认出NNT不足之处细胞内质的耗碳量(OCR) 随细胞核衍生物的分列传递而被降低(平面图3A)。值得一提的是的是，NNT不足之处细胞内质的最主要换气控制能力在不具体来说非振荡换气的情况下显着增大(平面图3B)。这提示细胞核硝醛弱点与NNT对氢反向的制约无关。鉴于NNT不足之处显着制约换气控制能力，于是检测NNT不足之处的H441细胞内质到底比NNT暗示细胞内质具有相当多的硝醛和更是强的糖酵解控制能力。这说明这些细胞内质在未NNT的情况下或许通过细胞核NADPH来源而持续细胞核的动态。

细胞核的硝醛葡萄糖具体来说ETC的动态，ETC由介导电子传递的Fe-S细胞内一硝醛氮都是由。考虑到Fe-S细胞内一硝醛氮的多肽操作过程需要NADPH，于是研究成果NNT妨碍后细胞核换气动态的降低到底与Fe-S细胞内涉及。细胞核担忧测试者可以对换气动态透过一般性的统计分析，但不可以对单个ETC一硝醛氮掺入透过风险评估。因此，写作者透过了更是为专业的实验来统计分析Fe-S细胞内倚赖的换气涉及一硝醛氮(I, II, III)。结果辨认出，基于一硝醛氮I(醛和苯甲醛)的摄入，在NNT妨碍后一硝醛氮I-III的活性显着增大(平面图3C)。此除此以外，NNT弱点细胞内质显着增大了翡翠醛的OCR，声称增大了翡翠醛脱氢蛋白质(SDH)活性和一硝醛氮II-III水量(平面图3D)。日益不堪重负这一情况的举足轻重状况是SDH在ETC和TCA反转之中必不可少双重角色。

除了通过ETC持续电子水量除此以外，Fe-S细胞内还持续对硝醛葡萄糖至关举足轻重的其他细胞内蛋白质的动态。为了明确NNT到底参与其他Fe-S细胞内的动态，写作者风险评估了TCA反转之中Fe-S细胞内——顺乌头醛蛋白质(ACO2)的活性。结果辨认出妨碍NNT显着增大了NSCLC细胞内质系之中ACO2的活性(平面图3E)。ACO2活性的增大或许则会毁损TCA反转，进而降低驱动ETC水量的转化成性物质的转化。为了补充非小细胞内质癌症之中ACO2动态的统计分析，于是评价Nnt暗示对KP癌症之中ACO2活性的制约。结果声称，Nnt+/+果蝇之中Aco2活性显着大于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11之中的，缺乏Nnt的观感借助于最低的活性(平面图3F)。

4 除此以外源性NADPH在NNT不足之处后持续Fe-S细胞内动态

为了明确与妨碍NNT涉及的细胞核Fe-S细胞内动态的增大到底与NADPH:NADP+的增大有关，我们试平面图提供一种细胞核NADPH的除此以外源性来源。为了借助这一目的，我们考虑了糖类细胞核之中NADH激蛋白质pos5p，它可以磷醛化NADH而诱发NADPH。虽然pos5p以前在细菌之中也有除此以外源暗示，但据我们知晓，pos5p还未被引入爬行动物系统。为了检测我们到底很难有效地在生命NSCLC细胞内质的细胞核之中暗示pos5p细胞内，我们对糖类细胞内透过了修饰，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9细胞内质的细胞核之中成功暗示了HA-tag标记的pos5p细胞内(平面图4A)。考虑这些细胞内质系是为了风险评估pos5p修缮和NNT不足之处涉及的Fe-S细胞内弱点的控制能力，辨认出妨碍NNT后对它们造成很不堪重负的制约。

pos5p的暗示挽救了细胞内质之中妨碍NNT后惹来的NADPH: NADP+分之一的降低(平面图4B)。这与暗示pos5p细胞内质之中pos5p扰后换气末端比较简单社区活动的降低有关(平面图4C和4D)。此除此以外，pos5p的暗示完全挽救了NNT妨碍后ACO2活性的降低(平面图4E)。总之，这些信息声称持续NNT暗示不足之处时NADPH的水准可以庇护所NSCLC细胞内质之中Fe-S细胞内的动态。

5 NNT的不足之处不则会毁损Fe-S细胞内的多肽

考虑到细胞核除此以外源性NADPH很难西移动NNT不足之处涉及Fe-S细胞内的弱点，并且NADPH是高效持续Fe-S细胞内多肽的必备条件，因此我们月里试平面图明确NNT活性到底持续这一操作过程。Fe-S细胞内多肽频发在一个由胺基醛脱硫蛋白质(NFS1)和Fe-S支架细胞内(ISCU)都是由的多细胞内一硝醛氮之中。一硝醛氮之中任何一种掺入的不足之处都则会制约多肽，并且也与细胞核弱点涉及。因此，我们妨碍NFS1或ISCU暗示来研究成果毁损Fe-S细胞内多肽后对换气末端和ACO2的制约。

在H2009细胞内质之中，妨碍NFS1后显着增大醛/苯甲醛反应会和翡翠醛反应会之中换气末端一硝醛氮I-III的活性，而在PC9细胞内质之中只有一硝醛氮II-III活性被显着增大(平面图5A和5B)。另除此以外，两个细胞内质系之中，在醛/苯甲醛和翡翠醛的功用下，妨碍ISCU暗示后显着西移动了OCR(平面图5A和5B)。并且妨碍NFS1或ISCU后显着增大了细胞内质系之中ACO2活性(平面图5C)。寻常的是，NNT妨碍后所惹来的弱点与Fe-S细胞内多肽所需物质造成的弱点是同等举足轻重的(平面图5A-5C)。

为了断言Fe-S细胞内弱点对NSCLC细胞内质的细胞核葡萄糖有动态性制约，我们对妨碍NNT或ISCU细胞内质透过基于相态色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的葡萄糖组学研究成果。 对这些细胞内质TCA反转的葡萄糖物透过统计分析，结果显示大多数之下方催化反应的同位素频发了显着转变(平面图5D)。这些都声称了硝醛葡萄糖的毁坏和Fe-S细胞内动态弱点的一致性。具体地说就是妨碍NNT和ISCU暗示后，醛、苯甲醛和富马醛被损耗。NNT不足之处细胞内质之中的柠檬醛水准被耗尽，但妨碍ISCU细胞内质之中并未此结果。另除此以外，妨碍ISCU细胞内质之中翡翠醛大量受益，而在NNT不足之处细胞内质之中则不具体来说此情况(平面图5D)。

除了Fe-S细胞内ACO2和SDH除此以外，TCA反转还具体来说另一种细胞核Fe-S细胞内——硫辛醛裂解蛋白质(LIAS)的动态。LIAS对于硫辛醛的裂解以及举足轻重硫辛硼双键的共轭都更是为决定性，硫辛硼双键由PDH (E2)和α-苯戊二醛脱氢蛋白质(二氢硫辛甲基S-翡翠酰转移蛋白质，DLST)都是由。LIAS对Fe-S细胞内多肽的毁损特别极端，因为其Fe-S簇在催化操作过程之中被损耗掉，这就尽快不断地透过细胞内互换。事实上，妨碍NFS1和ISCU暗示则会大量降低PC9细胞内质之中PDH-E2和DLST的脂化，然而妨碍NNT对细胞内脂化无制约(平面图5E)。总的来说，这些信息声称，NNT引致蛋白质和葡萄糖弱点，它们的弱点与Fe-S细胞内多肽的毁损涉及，但NNT不或许直接制约这一操作过程。这反映借助于妨碍NNT和ISCU后对TCA反转诱发类似但又相同的制约。

6 NNT的不足之处毁损氨基醛葡萄糖

除了损耗TCA反转除此以外，NNT弱点细胞内质的LC-HRMS葡萄糖组学统计分析声称氨基醛葡萄糖失调。妨碍NNT有利于长末端脂肪烷基甲硫氨酸的大量受益，而长末端脂肪烷基甲硫氨酸是氨基醛β-硝醛的底物(平面图6A)。鉴于在NNT弱点细胞内质之中具体来说换气系统弱点，我们断定这些烷基甲硫氨酸的减少是由于氨基醛硝醛降低。我们辨认出在H1299和PC9细胞内质之中OCR与橄榄硼的硝醛有关，妨碍NNT后OCR增大(平面图6B)。我们还检视到NNT弱点细胞内质之中饱和氨基醛和不饱和氨基醛均大量受益(平面图6C)。氨基醛裂解需要损耗大量NADPH，而且NNT妨碍后NADPH的持续性增大，于是我们认为这些氨基醛水准的减少是由于除此以外源性氨基醛摄入的减少。另除此以外，我们辨认出，NNT弱点细胞内质提升了对荧光橄榄醛类似物的吸收控制能力(平面图6D)。为了评价NNT妨碍后氨基醛的受益到底是一个潜在的不利因素，我们用于饱和氨基醛橄榄醛酯刺激NNT弱点细胞内质24小时，辨认出NNT妨碍后使H1299和H2009细胞内质对橄榄硼极端(平面图6E)。此除此以外，NNT妨碍后显着减低了H1299和PC9细胞内质对单一不饱和氨基醛油硼的持续性(平面图6F)。鉴于除此以外源性氨基醛补充的危害制约，我们预计细胞内质除此以外骨骼肌损耗将庇护所NNT的不足之处。令人震惊惊讶的是，糖类菌之中的骨骼肌损耗日益不堪重负了NNT的缩水(平面图6G)。更是举足轻重的是，NNT妨碍后细胞内质除此以外骨骼肌依靠则会减少NADPH的损耗(平面图6H)，这声称在缺乏除此以外源性氨基醛的情况下被迫裂解氨基醛，使NNT弱点细胞内质之中NADPH的持续性增大。总的来说，这些信息声称NNT或许在可调氨基醛葡萄糖之中起举足轻重功用，NSCLC细胞内质的氨基醛葡萄糖紊乱或许是一个可透过的弱点。

7 NNT不足之处后细胞核核醛氢化蛋白质(MitoCatalase)挽救Fe-S细胞内动态

Fe-S细胞内对分子碳和更是多危害物质的硝醛更是为极端。虽然我们未检视到细胞核细胞内抗硝醛系统的硝醛静止状态频发转变，但这未必排除NNT妨碍后引致的细胞核ROS有限将这些持续性辅因子硝醛。为了探讨这种先前，我们用于了细胞核核醛的氢化蛋白质(MitoCatalase)来提升细胞核的抗硝醛控制能力。我们成功地在H1299、H2009和PC9细胞内质之中过暗示了MitoCatalase (平面图7A)。MitoCatalase的暗示也大部分西移动了NNT妨碍后涉及细胞核之中H2O2的诱发(平面图7B)。这与NNT妨碍后换气末端比较简单社区活动的降低相对应(平面图7C和7D)。另除此以外，MitoCatalase的暗示恢复NNT妨碍后ACO2的活性(平面图7E)。综上所述，这些信息声称，减低细胞核药H2O2的控制能力可以避免NNT妨碍后Fe-S细胞内频发弱点，从而使NNT在避免Fe-S细胞内频发硝醛方面发挥功用，但对Fe-S簇的多肽无功用。

论点

总之，我们的研究成果声称，NNT对癌症生态学具有举足轻重意义，主要是通过调控Fe-S细胞内而有利于细胞核葡萄糖。与常规评价NNT动态的研究成果相同，我们描述了NNT对NSCLC之中细胞核硝醛转化成稳态的的关系制约。在NSCLC之中，NNT活性或许大大降低了大量硝醛葡萄糖惹来的硝醛应激反应会。我们的辨认出进一步声称了细胞核葡萄糖在癌症频发之中的重要性，说明细胞核动态的提升或许是癌症疗程的一个举足轻重抗癌药物。蛋白质TPH-1对胃庇护所起决定性功用，或许作为疗程CKD的潜在疗程抗癌药物。

类似借助于处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.